Identificación de genes de referencia en Lupinus mutabilis Sweet para estudios cuantitativos de expresión génica

Abstract

Los estudios de patrones de expresión en genes requieren mediciones precisas y reproducibles. Por lo que se requiere un control de reacción interno; es decir, un gen de referencia. El cual tenga una variación mínima en su expresión en diferentes tipos de células y bajo condiciones. Es así que muchos genes housekeeping han sido usados como genes de referencia en plantas; tales como, GAPDH, EF-1α, UBQ, UBC, EIF1 y factores de transcripción eucariota. Sin embargo, no siempre han sido apropiados. Además, el número de estos genes en plantas sigue siendo limitado y en Lupinus mutabilis S, no se han reportado. En ese sentido, se planteó identificar y validar genes de referencia en esta especie para estudios de expresión genética. Para ello, se trabajó con el transcriptoma de brotes florales en desarrollo y tejido vegetativo, el mismo que fue filtrado mediante 3 criterios de selección: 1) el coeficiente de variación (CV) <0.10 con un valor promedio de FPKM >10, 2) 5 pruebas de homogeneidad de varianza: Levene, Barlett, F-test, Fligner-Kligner y Hartley (p. valor > 0.05) y 3) CV del p. valor < 0.20 con un valor promedio de FPKM >40. Lo que resultó en la selección de 16 candidatos a genes de referencia. Los mismos que fueron validados por RTPCR en hoja, tallo y raíz. Finalmente, se identificaron 8 genes: RPL11, RPS18, RPS27L, ERF3, OEP24, CESA, AT4G27220, y V-ATPasa, que mostraron un nivel de expresión constante y sin diferencias significativas (P<0.05) a nivel de hoja, tallo y raíz para Lupinus mutabilis bajo condiciones de solución hidropónica La Molina y los genes (RAD52-2 Y CESA) presentaron estabilidad en su expresión, en dos tipos de tejido bajo condiciones de solución hidropónica La Molina y Murashige y Skoog, respectivamente.

Gene expression studies require precise and reproducible measurements. Therefore, a reference gene as internal reaction control is needed; which shows a minimal variation in its expression at different tissues under different conditions or treatments. Thus, many housekeeping genes have been used as reference genes in plants; such as, GAPDH, EF-1, UBQ, UBC, EIF1 and eukaryotic transcription factors. However, they have not always been appropriate for gene expression studies. Furthermore, the number of these genes in plants remains limited and there are not studies in Lupinus mutabilis S. Thus, the aim of this research was to identify and validate reference genes in this species for gene expression studies. For this, we worked with the transcriptome of the developing flower buds and vegetative tissue, which was filtered through three selection criteria: 1) the coefficient of variation (CV) < 0.10 with an average value of FPKM > 10, 2) five tests of homogeneity of variance: Levene, Barlett, F-test, Fligner-Kligner and Hartley (p-value > 0.05) and 3) CV of p-value < 0.20 with an average value of FPKM > 40. This allowed to selected 16 candidate reference genes, which were validated by RT-PCR in leaf, stem and root. Finally, 8 genes were identified: RPL11, RPS18, RPS27L, ERF3, OEP24, CESA, At4g27220, and VATPase, these genes showed a constant expression level and without significant differences (P <0.05) at the leaf, stem and root level for Lupinus mutabilis S. that were grown with La Molina hydroponic solution and two genes (RAD52-2 and CESA) showed gene expression stability under La Molina and Murashige and Skoog Basal Nutrient solution conditions, respectively.