Efecto de la adición de kit ligand y/o bpV (HOpic) sobre la activación y sobrevivencia in vitro de folículos preantrales de alpacas

Abstract

En los mamíferos, la foliculogénesis comienza en la etapa fetal y es un proceso complejo y dinámico que involucra la quiescencia, activación, crecimiento, la migración folicular basado en las interacciones con las células de la granulosa. En fetos de último tercio en alpacas se estima una población de folículos preantral de 80 000, que representa la reserva ovárica que será utilizada a lo largo de la vida reproductiva. Los mecanismos intraováricos que activan una pequeña cantidad de folículos primordiales es un proceso progresivo y altamente regulado. Siendo la alpaca una especie oriunda y de importancia económica en el Perú, los estudios que permitan la maximizar la conservación de germoplasma son de importancia para la ciencia. Por lo tanto, el objetivo del estudio fue evaluar el efecto de la adición de Kit Ligand (KL) (100 ng/mL) y/o bpV (HOpic) (10 μM) sobre la activación y sobrevivencia in vitro de folículos preantrales de alpaca. Se cultivaron fragmentos corticales ováricos de 11 alpacas adultas durante 24 h en medio de cultivo de tejidos (α-MEM+; Minimum Essential Medium) suplementado con bpV y KL o la asociación de ambos. En cada tratamiento dos fragmentos se fijaron en paraformaldehido (4% en PBS) antes y después de cultivo a 4° C para la histología clásica. Los tejidos se deshidrataron en alcohol, se aclararon con xileno y se incluyeron en parafina, y fue seccionado en serie a 7 μm con un micrótomo rotatorio (Leica). Las secciones histológicas se montaron y tiñeron con hematoxilina-eosina. Los folículos preantrales se clasificaron según su etapa de desarrollo primordial, primario y segundario. Nuestros resultados muestran una reducción de folículos primordiales (reserva) en más del 50% en tejido folicular cultivado in vitro en α-MEM+ o suplementado con bpV y/o KL versus el control (no cultivado). Asimismo, un incremento >25% de folículos primarios en tejido folicular cultivado in vitro en α-MEM+ o suplementado con bpV y/o KL versus el control. Sin embargo, la tasa de sobrevivencia folicular evidencio un descenso del 20% en los tejidos cultivados, a excepción del tratamiento α-MEM+ suplementado con asociación de bpV y KL. En conclusión, la suplementación conjunta de bpV (10 μM) y KL (100 ng/mL) promovió la activación de folículos primordiales y mantuvo la sobrevivencia luego del cultivo in vitro de tejido ovárico de alpaca.

In mammals, folliculogenesis begins in the fetal stage and is a complex and dynamic process involving quiescence, activation, growth, and follicular migration based on interactions with granulosa cells. In fetuses of the last third in alpacas, a population of preantral follicles is estimated at 80,000, which represents the ovarian reserve that will be used throughout reproductive life. The intraovarian mechanisms that activate a small number of primordial follicles is a progressive and highly regulated process. Since the alpaca is a native species of economic importance in Peru, studies that allow maximizing the conservation of germplasm are important for science. Therefore, the objective of the study was to evaluate the effect of the addition of Kit Ligand (KL) (100 ng/mL) and/or bpV (HOpic) (10 μM) on the in vitro activation and survival of alpaca preantral follicles. Ovarian cortical fragments from 11 adult alpacas were cultured for 24 h in tissue culture medium (α-MEM+; Minimum Essential Medium) supplemented with bpV and KL or the combination of both. In each treatment two fragments were fixed in paraformaldehyde (4% in PBS) before and after culture at 4°C for classical histology. The tissue was dehydrated in alcohol, cleared with xylene and embedded in paraffin, and serially sectioned at 7 μm with a rotary microtome (Leica). Histological sections were mounted and stained with hematoxylin-eosin. Preantral follicles were classified according to their stage of primordial, primary, and secondary development. Our results show a reduction of primordial (reserve) follicles by more than 50% in follicular tissue cultured in vitro in α-MEM+ or supplemented with bpV and/or KL versus the control (uncultured). Likewise, a >25% increase in primary follicles in follicular tissue cultured in vitro in α-MEM+ or supplemented with bpV and/or KL versus control. However, the follicular survival rate showed a decrease of 20% in the cultured tissues, except for the α-MEM+ treatment supplemented with an association of bpV and KL. In conclusion, the joint supplementation of bpV (10 μM) and KL (100 ng/mL) promoted the activation of primordial follicles and maintained survival after in vitro culture of alpaca ovarian tissue.