Evaluación del desarrollo embrionario en ovocitos bovinos madurados in vitro con la adición de antioxidante y moduladores de cAMP

Abstract

La adición de antioxidantes y moduladores de cAMP durante la maduración in vitro (IVM) puede desempeñar un papel decisivo en el desarrollo embrionario previo a la implantación. Los antioxidantes protegen a las células de los radicales libres y los efectos de las ROS por el estrés oxidativo. Los modulares de cAMP son los reguladores para mantener la detención meiótica al suprimir la activación del factor promotor de la maduración (MPF). Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el desarrollo embrionario en ovocitos bovinos madurados in vitro con la adición de antioxidante y moduladores de cAMP. Para determinar el nivel de antocianina que maximiza el incremento en cantidad y calidad de blastocitos desarrollados al día 7 de cultivo in vitro se utilizaron 462 COCs (n=462) obtenidos de los ovarios de camal en cinco tratamientos con diferentes niveles de antocianina (0, 1, 10, 20 y 40 uM). En este segundo experimento se evaluó la interacción de moduladores de cAMP suplementados en IVM para maximizar la cantidad de blastocitos. Se utilizaron 181 COCs en cuatro tratamientos de pre-IVM por 2 h (control, 1mM de dbcAMP, 0.5 mM de IBMX, 1,0 mM de dbcAMP + 0,5 mM IBMX), seguidamente, los COCs fueron transferidos a un medio IVM por 22 h para completar la maduración in vitro. Posteriormente, fueron fecundados in vitro por 18 h y cultivados in vitro por siete días en condiciones de 5 % CO2 a 38°C. La evaluación de los tratamientos se realizó en tres etapas del desarrollo embrionario; día 3 (tasa de clivaje), día 5 (tasa de mórula) y día 7 (tasa de blastocisto). Los datos se procesaron con análisis de varianza (ANOVA) y análisis de medias (prueba de Tukey) p< 0,05 utilizando IBM SPSS Statistics 2.0 para Windows. Los resultados de los grupos con suplementación de antocianinas y moduladores de cAMP no mostraron diferencias estadísticas (p < 0,05) en la tasa de clivaje y blastocistos. Aunque, numéricamente, la adición de 1 μM de antocianina (28.8 %) y 1mM de dbcAMP (34.7 %) en los medios IVM, mostró las mayores tasas de blastocistos. En conclusión, la suplementación de antocianinas y moduladores de cAMP no mejora la tasa clivaje y blastocistos en bovinos, requiriendo estudios complementarios a nivel celular y de expresión génica.

Addition of antioxidants and cAMP modulators during in vitro maturation (IVM) may play a decisive role in preimplantation embryonic development. Antioxidants protect cells from free radicals and the effects of ROS due to oxidative stress. cAMP modulators are the regulators to maintain meiotic arrest by suppressing the activation of maturation-promoting factor (MPF). Therefore, the objective of this study was to evaluate bovine embryonic development from oocytes matured in vitro with the addition of antioxidant and cAMP modulators. In the experiment I, to determine the level of anthocyanin that maximizes the increase in quantity and quality of blastocysts developed on day 7, 462 COCs (n=462) were recovered from slaughterhouse and were placed intro five treatments with different levels of anthocyanin (0, 1, 10, 20 and 40 uM). In experiment II, to evaluate the effect of cAMP modulators supplemented in IVM, 181 COCs were placed into four pre-IVM treatments for 2 h (control, 1 mM dbcAMP, 0.5 mM IBMX, 1.0 mM dbcAMP + 0.5 mM IBMX), after that the COCs were transferred to IVM medium. for 22 hours to complete in vitro maturation. Subsequently, they were fertilized for 18 h and cultured for seven days under conditions of 5 % CO2 at 38°C. The evaluation of the treatments was carried out in three stages of embryonic development; day 3 (cleavage rate), day 5 (morula rate) and day 7 (blastocyst rate). Data were processed with analysis of variance (ANOVA) and analysis of means (Tukey's test) p < 0.05 using IBM SPSS Statistics 2.0 for Windows. The results of the groups with anthocyanin supplementation and cAMP modulators showed no statistical differences (p < 0.05) in cleavage and blastocyst rate; although, the addition of 1 μM anthocyanin (28.8 %) and 1 mM dbcAMP (34.7 %) in the IVM media showed the highest blastocyst rates. In conclusion, supplementation of anthocyanins and cAMP modulators does not improve the cleavage rate and blastocysts in cattle, requiring complementary studies at the cellular and gene expression level.