Identificación de oligopéptidos con actividad fotoprotectora mediante un tamizado genético en la levadura Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Se reportan dos metodologías basadas en tamizados genéticos para la identificación de oligopéptidos con secuencia semialeatoria que posean actividad fotoprotectora utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se generó una biblioteca de plásmidos que codifica a dichos oligopéptidos mediante clonaje in vivo. La cepa mutante de levadura Δrad9 fue transformada con el plásmido de expresión pEGH y plantillas semialeatorias de ADN. Dos procesos de tamizaje genético se desarrollaron en paralelo. En el primero, la levadura transformada fue inducida en caldo conteniendo galactosa, plaqueada en un medio selectivo y expuesta a irradiación UVB (302nm). Se evaluó la capacidad fotoprotectora de los oligopéptidos expresados en las colonias sobrevivientes mediante sembrado en áreas de mayor dimensión e irradiación inmediata. Se extrajo los plásmidos de los candidatos que presentaron un mayor crecimiento y se confirmó la presencia de los fragmentos clonados mediante digestión con enzimas de restricción. Se transformó a los plásmidos en la cepa de levadura Δrad24. Los transformantes fueron replicados en placas conteniendo medio inductor e irradiados. Los sobrevivientes fueron sometidos a tamizajes consecutivos por sembrado y plaqueo en diluciones seriadas, donde tres candidatos fueron seleccionados. En el segundo método de tamizaje, se plaqueó a los transformantes iniciales en Δrad9 en medio selectivo. Posteriormente, se realizó pruebas de irradiación por replica de placa, tamizaje por sembrado y plaqueo con diluciones seriadas. Se recuperaron los plásmidos seleccionados para una segunda confirmación con la cepa mutante Δrad24, obteniéndose un candidato resistente a irradiación UV. Se analizó la expresión plasmídica de los candidatos obtenidos en ambos procesos de tamizaje a través de Western Blot, confirmando la presencia de los oligopéptidos fusionados a glutatión-S-transferasa (GST). Adicionalmente, 3 candidatos fueron secuenciados confirmando la ubicación de tirosina en las posiciones esperadas, y residuos de aminoácidos con carga como histidina, arginina y ácido glutámico. En conclusión, los métodos de tamizado genéticos de oligopéptidos semialeatorios permitieron la identificación de posibles péptidos biológicamente activos que poseen capacidad fotoprotectora.

Here, we report two genetic screening methods for the identification of semi-random oligopeptides with photoprotective activity using the yeast Saccharomyces cerevisiae. A plasmid library encoding for these oligopeptides was generated through in vivo cloning. The Δrad9 yeast mutant strain was transformed with the pEGH expression plasmid and semi random DNA templates. Two genetic screenings were developed in parallel. In the first method, the transformed yeast was induced in a broth containing galactose, plated on selective media, and exposed to UVB radiation (302 nm). The photoprotective activity of the oligopeptides expressed in the surviving colonies was assessed by streaking in larger areas, followed by irradiation. Plasmids were extracted from candidates that showed greater growth, and the presence of cloned fragments was confirmed through restriction digestion. These plasmids were transformed into the Δrad24 yeast strain. We used replica plating to irradiate transformants on inducing media. Survivors underwent consecutive screenings via streaking and plating of serial dilutions, resulting in the selection of three candidates. In the second screening method, the initial Δrad9 transformants were plated on selective media. Subsequently, irradiation tests were conducted by replica plating, streaking, and serial dilutions. The selected plasmids were recovered for a second confirmation with the Δrad24 mutant strain, yielding one UV-resistant candidate. The plasmid expression of candidates obtained in both screenings was analyzed via Western Blot, confirming the presence of oligopeptides fused to glutathione-S-transferase (GST). Additionally, through sequencing we confirmed the presence of tyrosine, as expected, and other charged amino acid residues such as histidine, arginine, and glutamic acid. In conclusion, our genetic screening methods for semi-random oligopeptides enabled the identification of potential biologically active peptides with photoprotective properties.